【***** 使用手冊(cè)】液相色譜柱的系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相)內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)， 經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過(guò)程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來(lái)?！　〖友b保護(hù)柱　　保護(hù)柱的作用是過(guò)濾掉來(lái)自流動(dòng)相和樣品的化學(xué)“垃圾”同時(shí)也可以有效除去流動(dòng)相和樣品中的不溶物。盡管現(xiàn)在的色譜儀在流動(dòng)相吸入口、進(jìn)樣閥后部以及在色譜柱的兩端都裝有1、2μm等不同孔徑的濾器，但濾器只能除去不溶性顆粒而不能除去化學(xué)污然，因此，加裝保護(hù)柱是必要的，特別是在分析中藥、中成藥等復(fù)雜混合物和生物樣品時(shí)更是保護(hù)分析柱必不可少的措施?！　”Ｗo(hù)柱填料應(yīng)與分析柱一致，粒徑可較分析柱大。保護(hù)柱屬消耗品，經(jīng)過(guò)**次數(shù)的樣品分析(50～100次)后，出現(xiàn)柱壓顯著升高或峰形變壞或基線漂移時(shí)，應(yīng)考慮更換保護(hù)柱?！　∵^(guò)濾流動(dòng)相和樣品　　流動(dòng)相通常由水或緩沖溶液與有機(jī)溶劑混合而成，原則上，所有經(jīng)過(guò)色譜柱的流動(dòng)相均應(yīng)過(guò)濾，但在實(shí)際操作上應(yīng)視具體情況而有所區(qū)別：當(dāng)有機(jī)溶劑用色譜純級(jí)，水用石英亞沸水或其它超純水時(shí)，在能確保水和有機(jī)溶劑的質(zhì)量且沒(méi)有受到污染時(shí)，過(guò)濾并無(wú)更多實(shí)際意義。　　當(dāng)流動(dòng)相中含有緩沖鹽時(shí)，則過(guò)濾是必要的，如前所述，當(dāng)緩沖溶液放置一段時(shí)間(視環(huán)境溫度不同而異，夏季一般不超過(guò)48 h，冬季一般不超過(guò)一周)后，在使用前還應(yīng)重新過(guò)濾?！　∷渲频臉悠吩囈涸谧⑷肓髀废到y(tǒng)前均要經(jīng)0. 45μm(0.22μm則更好)孔徑濾膜過(guò)濾。要注意區(qū)分水系和油系，二者不可混用，以防止濾膜溶解而造成污染。裝流動(dòng)相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線濾器要定期清洗和更換，以避免濾器因過(guò)載而起不到過(guò)濾作用?！　艋瘶悠贰　‘?dāng)樣品中含有對(duì)色譜柱有損害的化學(xué)成分，如產(chǎn)生*性吸附的蛋白質(zhì)、糖等有機(jī)分子和強(qiáng)吸附性物質(zhì)，以及可能對(duì)柱填料產(chǎn)生破壞作用的基團(tuán)離子。在進(jìn)樣前應(yīng)盡可能對(duì)樣品進(jìn)行分離提純以除去多余雜質(zhì)組分?！　”苊膺^(guò)高的柱壓　　雖然液相色譜柱能耐受的壓力可達(dá)6000psi(磅/平方英寸) ，但過(guò)高及過(guò)大的壓力變化均會(huì)縮短色譜柱的壽命，避免的方法是　　(1)柱壓過(guò)高時(shí)，盡可能采用較小的流速，以不超過(guò)柱大允許壓力的一半為宜?！　?2)當(dāng)流速較大時(shí)，應(yīng)采取流速梯度的辦法使流速分步到位?！　?3)使用手動(dòng)進(jìn)樣閥時(shí)，進(jìn)樣閥的切換要盡可能的快。否則超過(guò)20%的壓力沖擊會(huì)很快使柱報(bào)廢。當(dāng)使用多柱聯(lián)用時(shí)，柱切換要避免在高壓下進(jìn)行。　　注意溫度和酸堿度　　一般以硅膠為基質(zhì)的色譜柱高使用溫度不超過(guò)60℃，以低于40℃為宜，特別是在流動(dòng)相pH接近使用限度時(shí)，更應(yīng)降低使用溫度。溫度過(guò)高會(huì)加快鍵合相的水解和硅膠的溶解，從而，使填料性質(zhì)改變，柱床塌陷，降低柱效，改變峰形。目前的鍵合硅膠色譜柱標(biāo)示的pH適用范圍可達(dá)2～10，但在實(shí)際使用時(shí)應(yīng)避免**的pH條件，特別是在偏堿性的條件(pH≥8)下使用，如必須要在**的pH條件下使用時(shí)，可通過(guò)以下方法避免柱損害：　　(1)在泵和進(jìn)樣閥之間加裝預(yù)柱(飽和柱)來(lái)飽和流動(dòng)相；　　(2)降低使用溫度；　　(3)檢驗(yàn)完畢后立即用與所使用的流動(dòng)相互相混溶的“溫和溶劑”**清洗?！　≌_及時(shí)的沖洗　　開(kāi)始試驗(yàn)前，應(yīng)了解柱中當(dāng)前是何種溶劑。對(duì)于新色譜柱，如無(wú)特殊說(shuō)明均為評(píng)價(jià)報(bào)告中所用流動(dòng)相。柱中當(dāng)前溶劑**要與分析樣品所用流動(dòng)相互溶，如不能混溶，要用與二者均能相互混溶的第三種溶劑過(guò)渡。異丙醇是*能與各種溶劑混溶的試劑，可作為中介流動(dòng)相使用。反相鍵合硅膠柱適宜的保存環(huán)境是純甲醇，如分析用流動(dòng)相為緩沖液2有機(jī)溶劑，可先用較低甲醇含量(<20%)的甲醇2水置換掉原來(lái)的純甲醇，再進(jìn)分析用流動(dòng)相，以防止在柱內(nèi)發(fā)生鹽的沉淀；試驗(yàn)結(jié)束后，要及時(shí)用適當(dāng)?shù)娜軇_洗系統(tǒng)并終過(guò)渡到純甲醇沖洗，對(duì)于含有緩沖鹽的流動(dòng)相，辦法是先用與分析用流動(dòng)相組成**相同但不含緩沖鹽的溶液進(jìn)行沖洗，再逐步過(guò)渡到純甲醇沖洗。多數(shù)報(bào)道沖洗液體積大約為柱容積的15～20倍，但終要以基線是否平直、壓力是否穩(wěn)定決定。有些廠家的色譜柱標(biāo)明了流動(dòng)相中有機(jī)相的低使用濃度為≥5% ，使用時(shí)應(yīng)給予注意。 液相色譜圖異常的問(wèn)題、原因與解決方法

　　液相色譜中的許多問(wèn)題都能在譜圖上反映出來(lái)，其中有一些問(wèn)題可以通過(guò)改變?cè)O(shè)備參數(shù)得到解決；而其他的問(wèn)題必須通過(guò)修改操作程序來(lái)解決。對(duì)于色譜柱和流動(dòng)相的正確選擇是得到好的色譜圖的關(guān)鍵。而面對(duì)常常發(fā)現(xiàn)的HPLC譜圖異常的問(wèn)題，如何做到真正解決問(wèn)題，則需堅(jiān)持這幾個(gè)原則：一具體問(wèn)題具體對(duì)待原則：二先外設(shè)后內(nèi)部原則：三由簡(jiǎn)而繁原則：四單一處理到綜全處理原則。

　　一、拖尾峰

　　1、篩板阻塞:柱子兩頭的過(guò)濾篩板如果堵塞，樣品就會(huì)在篩板部分受阻而形成時(shí)間延遲，使得樣品在柱后流出時(shí)峰型形成拖尾。需要通過(guò)反沖色譜柱，或者更換篩板。

　　2、色譜柱塌陷:是指色譜柱由于其它原因引起了柱效率喪失，不能對(duì)物質(zhì)形成保留，使得物質(zhì)不在固定相上保留而隨流動(dòng)相流出，但是又還有一點(diǎn)柱效，因此形成拖尾。需要重新填充色譜柱或者更換色譜柱。

　　3、有污染:即樣品不在同一起跑線起跑，從后面開(kāi)始跑得到達(dá)終點(diǎn)稍晚，表現(xiàn)出拖尾。更換色譜柱或者采用有機(jī)溶劑梯度洗脫1h以上，以沖洗柱子。

　　4、流動(dòng)相PH值選擇錯(cuò)誤:如某PH下有的樣品存在分子型和離子型的動(dòng)態(tài)平衡，離子型的陸續(xù)向分子型轉(zhuǎn)化就會(huì)表現(xiàn)出拖尾。調(diào)節(jié)PH值可抑制分子解離，改善拖尾，對(duì)于堿性化合物，相對(duì)較低的PH值更有利于得到對(duì)稱峰。

　　二、前沿峰

　　1、樣品過(guò)載:被保留的樣品在正常出峰時(shí)間前陸續(xù)出來(lái)，形成前沿峰。降低樣品含量。

　　2、樣品溶劑選擇不恰當(dāng):當(dāng)樣品溶劑的洗脫能力大大強(qiáng)于流動(dòng)相時(shí)會(huì)出現(xiàn)前沿峰，例如，在反相色譜中用已腈做樣品溶劑，而流動(dòng)相的洗脫力較弱時(shí)會(huì)出現(xiàn)前沿峰。選擇流動(dòng)相或者接近流動(dòng)相的比例作為樣品溶劑。

　　3、色譜柱損壞:色譜柱柱效損失，不能對(duì)物質(zhì)形成保留。更換色譜柱。

　　4、假象前沿峰:在大峰前有小峰出現(xiàn),假象前沿峰，即大峰前包埋了沒(méi)有分開(kāi)的小峰。調(diào)整流動(dòng)相洗脫梯度。

　　三、基線漂移

　　1、柱溫波動(dòng):即使是很小的溫度變化都會(huì)引起基線的波動(dòng)，通常影響示差檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器、較低靈敏度的紫外檢測(cè)器或其它光電類檢測(cè)器。使用柱溫箱，控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，在檢測(cè)器之前使用熱交換器。

　　2、流動(dòng)相不均勻:流動(dòng)相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移。使用HPLC級(jí)的溶劑，流動(dòng)相在使用前進(jìn)行脫氣處理。

　　3、流通池被污染或有氣體:用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用鹽酸）。

　　4、流動(dòng)相配比不當(dāng)或流速變化:更改配比或流速，為避免這個(gè)問(wèn)題可定期檢查流動(dòng)相組成及流速。

　　5、樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì):以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線。使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間或在分析過(guò)程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。

　　四、出現(xiàn)寬峰

　　1、塔板數(shù)降低:色譜柱污染或失效，造成塔板數(shù)降低。更換同樣類型的色譜柱，如果新柱子可以提供對(duì)稱的色譜峰，則用強(qiáng)溶劑沖洗舊柱子。

　　2、管路太長(zhǎng)或管路內(nèi)徑太大:柱子與檢測(cè)器之間的管路太長(zhǎng)或管路內(nèi)徑太大。更換內(nèi)徑較小的短管路。

　　3、檢測(cè)器響應(yīng)過(guò)大:檢測(cè)器對(duì)反應(yīng)時(shí)間或池體積響應(yīng)過(guò)大。減少響應(yīng)時(shí)間或使用更小的流通池。

　　五、基線噪音

　　1、尖銳峰:在流動(dòng)相、檢測(cè)器或泵中有空氣。流動(dòng)相脫氣，沖洗系統(tǒng)以除去檢測(cè)器或泵中的空氣。

　　2、漏液:檢查管路接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封。

　　3、流動(dòng)相混合不**:用手搖動(dòng)使混合均勻或使用低粘度的溶劑。

　　4、溫度影響:柱溫過(guò)高，檢測(cè)器未加熱。使用柱溫箱，減少溫度差異或加上熱交換器。

　　5、偶然噪聲:在同一條線上有其他電子設(shè)備，斷開(kāi)LC、檢測(cè)器和記錄儀，檢查干擾是否來(lái)自于外部，加以更正。采用精密級(jí)穩(wěn)壓電源。

　　六、分離度不夠

　　1、流動(dòng)相梯度洗脫設(shè)置不合理:優(yōu)化梯度洗脫程序。

　　2、流動(dòng)相污染或變質(zhì):引起保留時(shí)間變化，重新配置流動(dòng)相。

　　3、保護(hù)柱或分析柱阻塞:去掉保護(hù)柱進(jìn)行分析，如果必要?jiǎng)t更換保護(hù)柱；如果分析柱阻塞，可進(jìn)行反沖；如果問(wèn)題仍然存在色譜柱可能被強(qiáng)保留的污染物損壞，建議使用恰當(dāng)?shù)脑偕绦?；如果?wèn)題仍然存在，進(jìn)口可能阻塞了，更換入口處的篩板或更換色譜柱。