1.流式細(xì)胞儀日常使用規(guī)范 　　【***** 使用手冊(cè)】流式細(xì)胞儀是一種對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析和分選的裝置，依據(jù)參數(shù)測(cè)量試驗(yàn)方法工作。流式細(xì)胞儀主要由流動(dòng)室和液流系統(tǒng)、激光源和光學(xué)系統(tǒng)、光電管和檢測(cè)系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)4部分組成，目前在生物醫(yī)療領(lǐng)域有廣泛運(yùn)用，主要用于分析細(xì)胞表面標(biāo)志、分析細(xì)胞受體、分析腫瘤細(xì)胞的DNA、RNA含量、分析免疫細(xì)胞的功能。　　由于流式細(xì)胞儀比較昂貴且精密，為了確保不因?yàn)槭褂貌划?dāng)就很容易使液流部位出問(wèn)題?！　?.一般來(lái)說(shuō)，需要使用的所用溶液都應(yīng)該進(jìn)行過(guò)濾處理，此外樣本在上機(jī)前也要過(guò)濾，這么做事為了避免設(shè)備長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí)出現(xiàn)沉淀物而堵塞噴嘴；　　2. 開(kāi)機(jī)后檢測(cè)樣本前，要用prime機(jī)檢查噴嘴的暢通狀況；　　3. 每日關(guān)機(jī)前移開(kāi)托臂，用3～4管10%次氯酸鈉反復(fù)沖洗，不要讓有堵塞的噴嘴帶病運(yùn)行，使用經(jīng)過(guò)濾處理的H2O或PBS沖洗后才關(guān)機(jī)；　　4. 每天要倒空廢液瓶?jī)?nèi)的廢液，再注入少量的次氯酸鈉或消佳凈溶液，以防**生長(zhǎng)；　　5. 鞘液瓶?jī)?nèi)的液體加至4/5容量并放置一夜，防止新加入的液體有氣泡產(chǎn)生而影響檢測(cè)結(jié)果。 2.巴玖講解流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)

流式細(xì)胞計(jì)的基本結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞計(jì)主要由四部分組成。它們是：流動(dòng)室和液流系統(tǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測(cè)系統(tǒng)；計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)。　?。?）流動(dòng)室和液流系統(tǒng)：流動(dòng)室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作。設(shè)計(jì)和制作均很精細(xì)，是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品，單個(gè)細(xì)胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被檢測(cè)細(xì)胞被限制在液流的軸線(xiàn)上。流動(dòng)室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號(hào)可發(fā)生振動(dòng)。　?。?）激光源和光學(xué)系統(tǒng)：經(jīng)特異熒光染色的細(xì)胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測(cè)。常用的光源有弧光燈和激光；激光器又以氬離子激光器為普遍，也有配和氪離子激光器或染料激光器。光源的選擇主要根據(jù)被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定。汞燈是常用的弧光燈，其發(fā)射光譜大部分集中于300～400nm，很適合需要用紫外光激發(fā)的場(chǎng)合。氬離子激光器的發(fā)射光譜中，綠光514nm和藍(lán)光488nm的譜線(xiàn)強(qiáng)，約占總光強(qiáng)的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見(jiàn)光部分，以647nm較強(qiáng)。免疫學(xué)上使用的一些熒光染料激發(fā)光波長(zhǎng)在550nm以上，可使用染料激光器。將有機(jī)染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發(fā)生改變以適應(yīng)需要即構(gòu)成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器,則可得到550～650nm連續(xù)可調(diào)的激光，尤在590nm處轉(zhuǎn)換效率、高，約可占到一半。為使細(xì)胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細(xì)胞上的激光光斑直徑應(yīng)和細(xì)胞直徑相近。因此需將激光光束經(jīng)透鏡會(huì)聚。光斑直徑d可由下式確定：d=4λf/πD。λ為激光波長(zhǎng)；f為透鏡焦距；D為激光束直徑。色散棱鏡用來(lái)選擇激光的波長(zhǎng)，調(diào)整反射鏡的角度使調(diào)諧到所需要的波長(zhǎng)λ。為了進(jìn)一步使檢測(cè)的發(fā)射熒光更強(qiáng)，并提高熒光訊號(hào)的信噪比，在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長(zhǎng)區(qū)段的光線(xiàn)濾除或通過(guò)。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC（Fluoresceinisothiocyanate,異硫氰熒光素）發(fā)射的525nm綠光通過(guò)。長(zhǎng)波通過(guò)二向色性反射鏡只允許某一波長(zhǎng)以上的光線(xiàn)通過(guò)而將此波長(zhǎng)以下的另一特定波長(zhǎng)的光線(xiàn)反射。在免疫分析中常要同時(shí)探測(cè)兩種以上的波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來(lái)有效地將各種熒光分開(kāi)?！　。?）光電管和檢測(cè)系統(tǒng)：經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過(guò)光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號(hào)而進(jìn)行測(cè)量的。光電倍增管（PMT）為常用。PMT的響應(yīng)時(shí)間短，僅為ns數(shù)量級(jí)；光譜響應(yīng)特性好，在200～900nm的光譜區(qū)，光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從103到108可連續(xù)調(diào)節(jié)　，因此對(duì)弱光測(cè)量**有利。光電管運(yùn)行時(shí)特別要注意穩(wěn)定性問(wèn)題，工作電壓要**穩(wěn)定，工作電流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；大陽(yáng)極電流在幾個(gè)毫安。此外要注意對(duì)光電管進(jìn)行暗適應(yīng)處理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT，因?yàn)楣庾V響應(yīng)特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極管的，它在強(qiáng)光下穩(wěn)定性比PMT好?！　腜MT輸出的電信號(hào)仍然較弱，需要經(jīng)過(guò)放大后才能輸入分析儀器。流式細(xì)胞計(jì)中一般備有兩類(lèi)放大器。一類(lèi)是輸出信號(hào)輻度與輸入信號(hào)成線(xiàn)性關(guān)系，稱(chēng)為線(xiàn)性放大器。線(xiàn)性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號(hào)以及代表生物學(xué)線(xiàn)性過(guò)程的信號(hào)，例DNA測(cè)量等。另一類(lèi)是對(duì)數(shù)放大器，輸出信號(hào)和輸入信號(hào)之間成常用對(duì)數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測(cè)量中常使用對(duì)數(shù)放大器。因?yàn)樵诿庖叻治鰰r(shí)常要同時(shí)顯示陰性、陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性三個(gè)亞群，它們的熒光強(qiáng)度相差1～2個(gè)數(shù)量級(jí)；而且在多色免疫熒光測(cè)量中，用對(duì)數(shù)放大器采集數(shù)據(jù)易于解釋。此外還有調(diào)節(jié)　便利、細(xì)胞群體分布形狀不易受外界工作條件影響等優(yōu)點(diǎn)?！　。?）計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)：經(jīng)放大后的電信號(hào)被送往計(jì)算機(jī)分析器。多道的道數(shù)是和電信號(hào)的脈沖高度相對(duì)應(yīng)的，也是和光信號(hào)的強(qiáng)弱相關(guān)的。對(duì)應(yīng)道數(shù)年縱坐標(biāo)通常代表發(fā)出該信號(hào)的細(xì)胞相對(duì)數(shù)目。多道分析器出來(lái)的信號(hào)再經(jīng)模-數(shù)轉(zhuǎn)換器輸往微機(jī)處理器編成數(shù)據(jù)文件，或存貯于計(jì)算機(jī)的硬盤(pán)和軟盤(pán)上，或存于儀器內(nèi)以備調(diào)用。計(jì)算機(jī)的存貯容量較大，可存貯同一細(xì)胞的6～8個(gè)參數(shù)。存貯于計(jì)算機(jī)內(nèi)的數(shù)據(jù)可以在實(shí)測(cè)后脫機(jī)重現(xiàn)，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，后給出結(jié)果。除上述四個(gè)主要部分外，還備有電源及壓縮氣體等附加裝置。

3.流式細(xì)胞儀的十大應(yīng)用 流式細(xì)胞儀的十大應(yīng)用

　　1、DNA倍體分析　　DNA分析是流式細(xì)胞儀***初且是現(xiàn)在應(yīng)用***廣檢測(cè)項(xiàng)目。由于惡性細(xì)胞DNA含量通常與正常細(xì)胞不同，存在異倍體細(xì)胞，所以現(xiàn)有很研究評(píng)價(jià)異倍體細(xì)胞與腫瘤惡性度及其預(yù)后的關(guān)系。DNA含量檢測(cè)還可提供細(xì)胞周期方面的信息，這在細(xì)胞生物學(xué)中運(yùn)用很廣泛。特別地，它可表示出細(xì)胞毒性**對(duì)細(xì)胞作用過(guò)程。這些DNA檢測(cè)還可與細(xì)胞表面標(biāo)志物標(biāo)記同時(shí)進(jìn)行，這樣在細(xì)胞混合培養(yǎng)中，可通常追蹤表達(dá)特異標(biāo)志物的細(xì)胞顯示其生長(zhǎng)周期情況。所有方法都是基于染料能與核酸起特異的化學(xué)反應(yīng)并發(fā)射出熒光，常用的染料為PI，DAPI。　　在該領(lǐng)域Partec公司的 CyFlow PA是一枝獨(dú)秀。　　2、細(xì)胞生存能力實(shí)驗(yàn)　　使用Heochest 33342染料與DNA特異性結(jié)合，后因細(xì)胞活力不同染料的結(jié)合程度也各異，故可評(píng)估細(xì)胞的活性度?！　?、計(jì)數(shù)外周血中檢測(cè)網(wǎng)織紅細(xì)胞　　使用TO染料能夠特異性地與RNA結(jié)合，結(jié)合系數(shù)高達(dá)3000，故具有很好的性?xún)r(jià)比?！　?、外周血、骨髓采集物中CD34陽(yáng)性干細(xì)胞計(jì)數(shù)，臨床上用于骨髓移植前干細(xì)胞數(shù)理的測(cè)定。使用標(biāo)準(zhǔn)ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE標(biāo)記CD34抗體，PE-CY5標(biāo)記CD45抗體?！　?、交叉淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)　　檢測(cè)識(shí)別供體血清中免疫球蛋白與受體粒細(xì)胞之間是否存在反應(yīng)有著重要臨床意義，因?yàn)檫@種反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致移植后發(fā)熱、移植后肺損傷及免疫性粒細(xì)胞缺乏癥。流式細(xì)胞儀可檢測(cè)全血樣本與血清孵育后粒細(xì)胞上結(jié)合的人免疫球蛋白。FITC標(biāo)記人免疫球蛋白抗體、PE標(biāo)記粒細(xì)胞表面標(biāo)志物、PE-CY5標(biāo)記HLA抗體?！　?、血小板自身抗體檢測(cè)　　血小板自身抗體識(shí)別人血小板抗原，會(huì)引起各種臨床相關(guān)癥狀，如新生兒自免性血小板減少癥、輸血后紫癜、難治性血小板減少。流式細(xì)胞可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)血小板自身抗體。FITC標(biāo)記抗人免疫球蛋白抗體、PE標(biāo)記識(shí)別血小板抗體。　　7、移植交叉配型　　原細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，主要用于避免移植物超急性排拆反應(yīng)。流式細(xì)胞儀用于監(jiān)測(cè)T或B細(xì)胞是否受到受體血清中免疫球蛋白攻擊，作為HLA配型前的預(yù)實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀因其高**性已成為該領(lǐng)域內(nèi)的金標(biāo)準(zhǔn)。FITC標(biāo)記抗人免疫球蛋白抗體、PE標(biāo)記識(shí)別T細(xì)胞CD3或B細(xì)胞CD29抗體?！　?、檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)抗原或細(xì)胞有絲分裂刺激后活化效應(yīng)淋巴細(xì)胞早期活化指標(biāo)CD69可用來(lái)檢測(cè)免疫**效果。流式細(xì)胞使用三色分析可監(jiān)測(cè)淋巴細(xì)胞各亞群活化情況：FITC標(biāo)記的CD3抗體、PE標(biāo)記的CD8抗體、PE-CY5標(biāo)記的CD69抗體。　　9、細(xì)胞增殖狀態(tài)檢測(cè)　　核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量細(xì)胞增殖分裂狀況，在評(píng)估腫瘤預(yù)后有重要意義。為些標(biāo)志物的檢測(cè)一般同細(xì)胞表面標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)。FITC標(biāo)記PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或（并）PE-CY5標(biāo)記細(xì)胞表面標(biāo)志物?！　?0、染色體分析　　流式細(xì)胞儀染色分析運(yùn)用兩種特異性染料：Hoechest33258與核苷酸AT結(jié)合；Chromomycin A3與GC相結(jié)合。從而在雙參數(shù)坐標(biāo)上根據(jù)染色體ATCG含量的不同識(shí)別各種染色體。平時(shí)進(jìn)行的染色體分析耗時(shí)且需要操作者**經(jīng)驗(yàn)，而用流式細(xì)胞儀時(shí)可快速地識(shí)別出異常染色體，如加配分選系統(tǒng)可將這些異常染色體分選出來(lái)作進(jìn)一步分析。