【***** 使用手冊】液相色譜是目前應(yīng)用多的色譜分析方法，液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點作出很多調(diào)整。液相色譜的流動相通常是各種低沸點溶劑和水溶液。它是影響分離的一個非常重要因素。在實際工作中，流動相的選擇和優(yōu)化是確定色譜分析的主要工作。　　選擇方法　　1、由強到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進行試驗，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例?！　?、三倍規(guī)則 ：每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況?！　?、粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)：當分離達到**程度，應(yīng)將有機溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變?！　∶摎夥椒ā　?、吹氦脫氣法　　利用氦氣在液體中溶解度比空氣低的特性，在0.1MPa壓力下，以約60mL/min流速通入流動相儲液容器中10～15min，可以很有效地從流動相中排除溶解的空氣，能排除接近80%的氧氣。采用一個分布式噴射流裝置，一體積的氦氣可從流動相中將等體積的幾乎**氣體排除。這意味著1L氦氣通過1L流動相就可完成排氣這個工作。這種脫氣方法雖然好，但氦氣價格較高，很少使用?！　?、加熱回流法　　此法的脫氣效果較好。在操作時要注意冷凝塔的冷卻效率，否則溶劑會丟失，混合流動相的比例會有變化?！　?、抽真空脫氣法　　此法可使用真空泵，降壓至0.05～0.07MPa，即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會使混合溶劑組成發(fā)生變化，從而影響到實驗的重現(xiàn)性，因此多用于單溶劑體系的簡單分析。　　4、超聲波脫氣法　　將欲脫氣的流動相置于超聲波清洗器中，用超聲波震蕩10～20min。此法的脫氣效果差。　　5、在線脫氣法　　HPLC儀器均可配置專門的在線脫氣機。在線脫氣使用簡單，低故障，有效?！　∽⒁馐马棥　?、流動相溶劑應(yīng)選擇HPLC的溶劑或依此為標準的溶劑。流動相使用前用0.45μm濾膜過濾、脫氣，**微粒和灰塵。 在送液泵內(nèi)，為了防止雜物(固體)進入流路，裝有吸濾器，但網(wǎng)孔徑為10μm，比此更小的顆粒仍然可通過，這會導(dǎo)致流路和柱子堵塞和污染。為此，建議常用0.45μm濾膜過濾。流動相溶劑須經(jīng)脫氣，如不脫氣，在溶劑混合時，或壓力溫度變化時容易產(chǎn)生大量氣泡，會導(dǎo)致泵誤動作和輸液不暢，檢測器產(chǎn)生噪聲信號等?！　?、流動相恢復(fù)到室溫后使用。流動相溫度與室溫相差時，流動相在恢復(fù)到室溫前，基線水平很難穩(wěn)定，特別是發(fā)生漂移，也容易產(chǎn)生氣泡等現(xiàn)象。水與有機溶劑混合時，混合液變化大，往往會與室溫相差很大，務(wù)必注意?！　?、做HPLC流動相的試劑應(yīng)用HPLC級的、水應(yīng)用二次蒸餾水，水相流動相需經(jīng)常更換，防止長菌變質(zhì)。使用去離子水、針劑水、純凈水(炊用)并不合適、尤其是做梯度洗脫時，水中的不純物會成為鬼峰，從而干擾分析結(jié)果?！　?、流動相的pH值過高或過低，流動相使用純水，使用高濃度磷酸鹽緩沖溶液，使用離子對試劑等，均可能造成色譜柱填料被化學(xué)破壞，這種對色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復(fù)的　　5、用緩沖鹽做流動相時，在使用前和使用后都要用水清洗流路，禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過夜或更長時間?！　?、若需要使用含鹽的流動相，使用前請務(wù)必過濾。并且使用該含鹽流動相前，色譜柱需先用低比例有機相(有機相含量應(yīng)不低于10%)的溶液沖洗，以免緩沖鹽析出。流動相若為蒸餾水或含鹽的緩沖液，建議現(xiàn)用現(xiàn)配，以免流動相因滋生微生物而造成柱填料的污染?！　?、進行梯度實驗時要注意梯度變化過程中流動相的互溶性，避免因流動相不互溶而導(dǎo)致的緩沖鹽析出問題。反相系統(tǒng)更換正相系統(tǒng)或正相系統(tǒng)更換反相系統(tǒng)時，用異丙醇置換系統(tǒng)內(nèi)的儲存流動相后在接柱子?！　?、在更換兩種互不相溶的流動相時，中間要用異丙醇溶液清洗過渡。例如：先用甲醇水做流動相，然后在用正己烷做流動相時，**要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水，然后用正己烷沖洗異丙醇，反之也是一樣。在更換流動相時還要考慮色譜柱是否更換。　　9、儀器在短期(兩三天)不用時，流路中可以是甲醇或水。儀器在長期不用時，流路中應(yīng)用甲醇?！　?0、對于UV等檢測器用于高靈敏度檢測時，要使用UV吸收性小的HPLC的溶劑作為流動相溶劑，如甲醇、乙腈等。　　11、當流動相溶劑為乙腈時，流速為1ml/min泵的正常壓力5～7Mpa之間，如果壓力逐漸降低，基線也出現(xiàn)異常。這是由于乙氰的粘性大，導(dǎo)致泵的流速降低?？蛇m當提高流速使泵的壓力恢復(fù)正常即可?！　?2、流動相含有濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化砜等溶劑，會對流路中的PEEK樹脂管路強度變成差、PEEK樹脂管容易破裂使溶劑外濺。流動相含有鹵素離子的溶劑，如KCI、NaCI、NH4CI等。對流路中的不銹鋼材料有腐蝕作用，以上的溶劑須盡量避免使用。非用不可時，分析完了后，應(yīng)立刻用蒸餾水把全流路清洗干凈?！　?3、用于檢定梯度等性能時，短時間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒有問題的?！　?4、注意：稀硝酸與甲醇不能混合，否則有可能會引起爆炸。 **液相色譜的幾大特點

　　**液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動相改為高壓輸送（***高輸送壓力可達4、9~107Pa）；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續(xù)檢測。

　　特點

　　1、高壓：液相色譜法以液體為流動相（稱為載液），液體流經(jīng)色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可達150～350×105Pa。

　　2、高速：流動相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快得多，一般可達1～10ml/min。**液相色譜法所需的分析時間較之經(jīng)典液相色譜法少得多，一般少于1h。

　　3、**：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。

　　4、高靈敏度：**液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測器，進一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達10-11g。另外，用樣量小，一般幾個微升。

　　5、適應(yīng)范圍寬：氣相色譜法與**液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優(yōu)點，但是受技術(shù)條件的限制，沸點太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進行分析。而**液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對于高沸點、熱穩(wěn)定性差、相對分子量大（大于400以上）的有機物（這些物質(zhì)幾乎占有機物總數(shù)的75%～80%）原則上都可應(yīng)用**液相色譜法來進行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%。