【導(dǎo)讀】液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以硅膠為柱，或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團的鍵合相硅膠柱;反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì)，在其表

液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以硅膠為柱，或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團的鍵合相硅膠柱;反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團（ODS）稱為C18柱，其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱，GPC柱，聚合物填料柱等。下面介紹一下反相色譜柱的選擇和使用：

一、反相色譜柱的選擇

1.柱子的PH值使用范圍

反相柱優(yōu)點是固定相穩(wěn)定，應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料，使用時**要注意流動相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8，流動相的PH值小于2時，會導(dǎo)致鍵合相的水解;當PH值大于7時硅膠易溶解;經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。一旦發(fā)生上述情況，色譜柱人口處會塌陷。同樣填料各種不同牌號的色譜柱不盡相同。如果流動相PH較高或經(jīng)常使用緩沖液時，建議選擇PH范圍大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH2-9或Zorbax的PH2-11.5的柱子。

2.填料的端基封尾（或稱封口）

把填料的殘余硅羥基采用封口技術(shù)進行端基封尾，可改善對極性化合物的吸附或拖尾;含碳量**了，有利于不易保留化合物的分離;填料穩(wěn)定性好了，組分的保留時間重現(xiàn)性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物，***好選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。

二、液相色譜柱的使用

色譜柱在使用前，***好進行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行（出廠測試所使用的條件是***佳條件），只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。

1、樣品的前處理

a、***好使用流動相溶解樣品。

b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。

c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。

2、流動相的配制

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：

a、流動相對樣品具有**的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）。

b、流動相與樣品不產(chǎn)生化學反應(yīng)c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果;降低柱壓降，延長泵的使用壽命（可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度）。

d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，***好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。

e、流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實驗無法進行。

f、在流動相配制好后，**要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

3、流動相流速的選擇

因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求***佳柱效，***好使用***佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。

當選用***佳流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間（如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量）。

注意：

a.含水流動相***好在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。***好加入疊氮化鈉，防止**生長。

b.流動相要求使用0.45μm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。

c.使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。

三.色譜柱的維護

1.色譜柱的平衡

反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的。新柱應(yīng)先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請**確保您分析樣品所使用的流動相和乙腈/水互溶。每天用足夠的時間以流動相來平衡色譜柱，您就會在處理問題方面獲得**的"補償"，而且您的色譜柱的壽命也會變得更長!操作步驟：

a.平衡開始時將流速緩慢地提高，用流動相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對試劑流速如果較低，則需要較長的時間來平衡）

b.如果使用的流動相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水"過渡"即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動相平衡;分析結(jié)束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護柱子。

2.色譜柱的再生

長期使用的色譜柱，往往柱效會下降（柱子的理論塔板數(shù)減低）?？梢詫ιV柱進行再生，在有條件的實驗室應(yīng)使用一個廉價的泵進行柱子的再生。

建議用來沖洗柱子的溶劑體積

色譜柱尺寸柱體積所用溶劑的體積

125-4mm1.6ml30ml

250-4mm3.2ml60ml

250-10mm20ml400ml

選擇再生方法：

極性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色譜填料）的再生：

正庚烷→→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**

非極性固定相（如反相色譜填料RP-18，RP-8，CN等）的再生：水→乙腈→（或異丙醇）→乙腈→水

注意：

a.在對NH2改性的色譜柱進行再生時，由于NH2可能以銨根離子的形式存在，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液**流出稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱，如果簡單的用有機溶劑/水的處理不能夠**洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。

3.色譜柱的維護

a.使用預(yù)柱保護分析柱（硅膠在極性流動相/離子性流動相中有**的溶解度）

b.大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2-7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍

c.避免流動相組成及極性的劇烈變化

d.流動相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理

e.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應(yīng)在實驗完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇或乙腈中

f.氯化物的溶劑對其有**的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕

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　　【***** 使用手冊】氣相色譜操作條件的選擇，常常決定是否能夠達到分離的目的，而選擇試驗條件的主要依據(jù)是范氏方程和分離度與各種色譜參數(shù)的關(guān)系式。氣相色譜柱分析條件的選擇主要包括柱溫、載氣種類和流速等的選擇。適當?shù)姆治鰲l件，可以在較短的時間內(nèi)完成分析工作，并達到良好的定性定量目的。在日常工作中，如何進行色譜柱分析條件的選擇呢？　　柱溫的選擇　　柱溫是影響分析時間和分離度的重要因素。選擇柱溫的依據(jù)是樣品的沸點范圍，固定液的配比，允許使用溫度，以及檢測器的靈敏度?！　≈鶞刂饕绊懛峙湎禂?shù)、容量因子以及組分在流動相和固定相中的擴散系數(shù)，從而影響分離度和分析時間。選擇溫柱的原則，一般是在使難分離物質(zhì)對達到要求的分離度條件下，盡可能采用低溫柱，其優(yōu)點是可以增加固定相的選擇性，降低組分在流動相中的縱向擴散，提高柱效，減少固定液的流失、延長柱壽命和降低檢測器的本底。　　提高柱溫可以使保留時間減少，加快分析速度，使樣品中組分**流出，但是分離效果不好。降低柱溫，樣品有較大的分配系數(shù)，選擇性高，有利于分離。但溫度過低，容易引起峰形拖尾或前伸，并且分析時間長。可根據(jù)固定液的使用溫度極限和樣品組分沸點調(diào)節(jié)柱溫?！　τ诟叻悬c混合物，在保證分離**的前提下，盡量降低柱溫?？稍诘陀诜治鑫锓悬c180℃～200℃的柱溫下進行分析；對沸點不太高(200～300℃)的樣品，柱溫可選100℃以下；對于氣體、氣態(tài)烴等低沸點混合物，一般選擇室溫或50℃以下進行分析。對于寬沸程樣品，需采用程序升溫法進行分離，即柱溫按預(yù)先設(shè)定的程序隨時間成線性或非線性增加，從而獲得分離效果?！　≥d氣的選擇　　一般說來，痕量分析或毛細管色譜的載氣純化程度，要高于常規(guī)分析。特別是電子捕獲、熱導(dǎo)池檢測器，載氣純度直接影響靈敏度和穩(wěn)定性，**要嚴格凈化?！　「鶕?jù)分析對象，對于色譜柱的類型，操作儀器的檔次和具體檢測器，若使用不合要求的低純度氣體，不良影響有以下幾種可能：　　a.樣品失真或消失：如H2O氣使氯硅樣品水解；　　b.色譜柱失效：H2O，CO2使分子篩柱失去活性，H2O氣使聚脂類固定液分解，O2使PEG固定液斷鏈；　　c.有時某些氣體雜質(zhì)和固定液相互作用而產(chǎn)生假峰；　　d.對柱保留特性的影響：如H2O對聚乙二醇等親水性固定液的保留指數(shù)會有所增加，載氣中氧含量過高時，無論是極性或是非極性固定液柱的保留特性，都會產(chǎn)生變化，使用時間越長影響越大；　　e.檢測器：TCD：信噪比減小，無法調(diào)零，線性變窄，文獻中的校正因子不能使用，氧含量過大，使元件在高溫時加速老化，減少壽命；FID：特別是在Dt≤1×10-11/S下操作時，CH4等有機雜質(zhì)會使基流激增，噪聲加大不能進行微量分析；　　f.在做程序升溫操作時，載氣中的某些雜質(zhì)，在低溫時保留在色譜柱中，當柱溫升高時不但引起基線漂移，還可能在譜圖上出現(xiàn)比較寬的“假峰”；　　g.儀器影響：各類過濾器加速失效；調(diào)節(jié)閥(穩(wěn)壓閥，穩(wěn)流閥，針形閥) 被污染，氣阻堵塞，調(diào)節(jié)精度降低或失靈；氣路系統(tǒng)被污染，若要恢復(fù)儀器在高靈敏度情況下操作，有時要吹洗很長時間(可能一周以上), 污染嚴重時有時再也無法恢復(fù)；對于FID，水蒸氣會影響分析結(jié)果，直至影響檢測器的壽命；對ECD和TCD的壽命明顯，這點應(yīng)引起用戶特別注意?！　≥d氣的壓力和流速　　載氣壓力對柱效率有直接的影響。如提高柱內(nèi)壓力，有助于提高柱效率。但只提高入口壓力，使流速加大且壓降太大時，反而會降低柱效率，因此也必須提高出口壓力。一般采用在柱后加裝適當氣阻的方法來解決這一問題。　　載氣流速主要影響分離效率和分析時間。為獲得高柱效，應(yīng)選用佳流速，但所需分析時間較長。為縮短分析時間，一般選擇載氣速度要高于佳流速，此時柱效雖稍有下降，卻節(jié)省了很多分析的時間。常用的載氣速度流速為20～80mL/min?！　τ贔ID 或FPD 檢測器，氫氣和空氣的比例是影響分離度和靈敏度的重要因素，只有反復(fù)試驗，才能確定適合的比例。對于填充柱色譜柱，載氣流入方向要盡量與色譜柱內(nèi)固定相裝填方向一致，以減小壓差，提率?！　∵M樣量的選擇　　進樣量的多少直接影響譜帶的初始寬度。因此，只要檢測器的靈敏度足夠高，進樣量越少，越有利于得到良好的分離。一般情況下，柱越長，管徑越粗，組分的容量因子越大，則允許的進樣量越多。一般氣體進樣量在1～10mL，液體進樣量在0.5～10μL 之間，可取得較好的分析效果。此外，進樣速度要快，進樣時間要短，以減少縱向擴散，有利于提高柱效。　　氣化溫度的選擇　　氣化溫度取決于樣品的揮發(fā)性、沸點范圍及進樣量等因素。氣化溫度選擇不當，會使柱效下降。通常氣化室的溫度選擇為樣品沸點或高于沸點，以保證樣品能瞬間氣化；但不要超過沸點50℃以上，以防止樣品分解?！　τ谝话愕臍庀嗌V分析，氣化溫度比柱溫高10～50℃即可。但對于某些高沸點組分或熱穩(wěn)定性差的組分，在其沸點左右分析會產(chǎn)生分解現(xiàn)象。此時應(yīng)采取的措施是減少進樣量，采用高靈敏度檢測器，氣化室溫度的選擇應(yīng)低于其沸點100～200℃?！　囊陨辖榻B的選擇原則可以看出，各種條件往往同時影響色譜柱的選擇性和效率，它們之間既密切聯(lián)系又互相制約。因此在實際分析中，要作綜合考慮，靈活地運用這些原則，既要保證良好的選擇性，又要保證分離效率，合理地選擇佳色譜分析條件。

當色譜柱使用一段時間以后，柱內(nèi)由于各種原因，滯留了一些高沸點組分或氧化物等，除柱效有所下降外，還可能出現(xiàn)基線波動或“鬼峰”。為了去除污染物，使柱效和基線恢復(fù)到原來的狀態(tài)，稱為色譜柱的再生。色譜柱的再生和柱老化有**區(qū)別和不同，它是柱在使用一段時間柱性能下降，經(jīng)處理后盡量恢復(fù)到原來性能的過程。A、色譜柱在以下幾種情況必須再生處理a.使一段時間，柱效明顯下降；b.柱被污染，特別是在程序升溫時，基線漂移和噪聲超過容忍程度或出現(xiàn)“鬼峰”；c.柱頭塌陷，柱床短路或斷位(在玻璃柱中容易發(fā)現(xiàn))，而出現(xiàn)尖峰或雙重峰；d.峰形展寬，保留時間明顯變化；e.待分離組分和固定相表面非特異性相互作用，引起保留時間較短的峰拖尾或出現(xiàn)雙峰；B、毛細管柱再生的幾種方法a.用載氣將色譜柱污染物沖洗出來；b.將柱頭截去100mm 或更長一些；c.若使用交聯(lián)的色譜柱，可在儀器上反復(fù)注射溶劑進行沖洗。常用的溶劑依次為丙酮、甲苯、乙醇、氯仿和二氯甲烷，每次可進樣5～10μL；d.交聯(lián)柱在儀器上沖洗無效時，可把柱拆下來用二氯甲烷或氯仿沖洗，溶劑用量視柱的污染程度而定，一般20mL 左右。C、色譜柱再生前應(yīng)注意的問題當分析出現(xiàn)問題時，不能只考慮是柱問題，而馬上進行再生。除上述情況外，還應(yīng)考慮樣品處理、進樣技術(shù)、操作有無失誤、數(shù)據(jù)處理參數(shù)有無改變等可能帶來的問題。a.襯管、預(yù)柱和檢測器被污染也會引起基線不穩(wěn)定、出現(xiàn)“鬼峰”或裂解峰；b.新的注射墊也會引起基線漂移和出現(xiàn)“鬼峰”；c.襯管密封欠佳、柱安裝死體積或檢測器固有特性也會引起較早出現(xiàn)峰的拖尾；d.分析系統(tǒng)發(fā)生變化(如漏氣嚴重)也可能使保留時間突變；e.峰變寬，除柱效下降外也可能由柱外效應(yīng)引起；f.進樣量太大也會引起峰變寬、拖尾或保留時間變短；g.色譜柱長時間樣品過載，保留時間也會變小等。D、色譜柱再生時應(yīng)注意的幾個問題1.如前所述和色譜柱老化一樣，不是溫度越高越好，時間越長越好；建議不要使用長時間烘烤的方法，來處理受到污染的色譜柱，因為烘烤時，溫度會把污染的殘留物變成不能溶解的物質(zhì)，再用溶劑清洗也無濟于事；2.儀器在高靈敏度操作時，如：量程在1×10-11A/mV以下，痕量分析程序升溫過程中，溫度升到大于180℃后，基線明顯漂移是不可避免的；3.不同類型柱子，再生方法不同；4.樣品種類、組分、進樣量不同或操作時間長短不同，再生方法也不同；5.儀器本身條件如：氣源種類、純度、凈化條件、進樣口結(jié)構(gòu)和操作檢測器不同，再生柱方法也有區(qū)別；6.高分子量組分污染色譜柱后，高溫再生時間長會導(dǎo)致固定相的老化；使用交聯(lián)或鍵合柱***好用溶劑漂洗再生，漂洗溶劑流動方向**要從柱出口注入。應(yīng)該注意，毛細管柱交聯(lián)鍵合率通常不到90%，因此會漂洗掉未化學結(jié)合的液相部分，所以保留時間和分離狀態(tài)會有所變化；7.對于難揮發(fā)物，碳化物是不能通過再生除去，對于填充柱***好使用帶襯管氣化室進樣器，對于毛細管可通過把柱入口切去30～50cm的方法除去污物段。有條件的可以使用預(yù)柱，把不揮發(fā)的有機物、無機物和顆粒材料阻留在預(yù)柱中，需要時更換預(yù)柱；8.在某些情況下，色譜柱要在溫度極限附近使用，這時基線漂移和大噪聲已不可避免，柱的再生要求只能視情況而定；9.不是所有色譜柱通過再生均能恢復(fù)原來性能。