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高效液相色譜常見問題分析與對(duì)策 液相色譜使用方法

時(shí)間:2023-01-05 09:30:03 作者:河北航信儀器 點(diǎn)擊:

【導(dǎo)讀】液相色譜系統(tǒng)的許多問題都能在譜圖上反映出來。其中有一些問題可以通過改變?cè)O(shè)備參數(shù)得到解決;而其他的問題必須通過修改操作程序來解決。對(duì)于色譜柱和流動(dòng)相的正確選擇是得到好的色譜圖的關(guān)鍵。A、峰拖尾原 因

液相色譜系統(tǒng)的許多問題都能在譜圖上反映出來。其中有一些問題可以通過改變?cè)O(shè)備參數(shù)得到解決;而其他的問題必須通過修改操作程序來解決。對(duì)于色譜柱和流動(dòng)相的正確選擇是得到好的色譜圖的關(guān)鍵。A、峰拖尾原 因 解決方法1、篩板阻塞 a、反沖色譜柱 b、更換進(jìn)口篩板 c、更換色譜柱2、色譜柱塌陷 填充色譜柱3、干擾峰 a、使用更長(zhǎng)的色譜柱 b、改變流動(dòng)相或更換色譜柱4、流動(dòng)相PH選擇錯(cuò)誤 調(diào)整PH值。對(duì)于堿性化合物,低PH值更有利于得到對(duì)稱峰5、樣品與填料表面的溶化點(diǎn)發(fā)生反應(yīng) a、加入離子對(duì)試劑或堿性揮發(fā)性修飾劑b、更改色譜柱 B、峰前延原 因 解決方法1、柱溫低 升高柱溫2、樣品溶劑選擇不恰當(dāng) 使用流動(dòng)相作為樣品溶劑3、樣品過載 降低樣品含量4、色譜柱損壞 見A1、A2C、峰分叉原 因 解決方法1、保護(hù)柱或分析柱污染取下保護(hù)柱再進(jìn)行分析。如果必要更換保護(hù)柱。如果分析柱阻塞,拆下來清洗。如果問題仍然存在,可能是柱子被強(qiáng)保留物質(zhì)污染,運(yùn)用適當(dāng)?shù)脑偕胧?。如果問題仍然存在,入口可能被阻塞,更換篩板或更換色譜柱。2、樣品溶劑不溶于流動(dòng)相 改變樣品溶劑。如果可能采取流動(dòng)相作為樣品溶劑。D、峰變形原 因 解決方法1、樣品過載 減少樣品載量E、早出的峰變形原 因 解決方法1、樣品溶劑選擇不恰當(dāng) a、減少進(jìn)樣體積 b、運(yùn)用低極性樣品溶劑F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰原 因 解決方法1、柱外效應(yīng) a、調(diào)整系統(tǒng)連接(使用更短、內(nèi)徑更小的管路) b、使用小體積的流通池G、K’增加時(shí),脫尾更嚴(yán)重原 因 解決方法1、二級(jí)保留效應(yīng),反相模式a、加入三乙胺(或堿性樣品) b、加入乙酸(或酸性樣品) c、加入鹽或緩沖劑(或離子化樣品) d、更換一支柱子 2、二級(jí)保留效應(yīng),正相模式a、加入三乙胺(或堿性樣品) b、加入乙酸(或酸性樣品) c、加入水(或多官能團(tuán)化合物) d、試用另一種方法3、二級(jí)保留效應(yīng),離子對(duì) 加入三乙胺(或堿性樣品)H、酸性或堿性化合物的峰拖尾原 因 解決方法1、緩沖不合適 a、使用濃度50-100mM的緩沖液 b、使用Pka等于流動(dòng)相PH值的緩沖液I、額外的峰原 因 解決方法1、樣品中有其他組份 正常2、前一次進(jìn)樣的洗脫峰 a、增加運(yùn)行時(shí)間或梯度斜率 b、提高流速3、空位或鬼峰 a、檢查流動(dòng)相是否純凈 b、使用流動(dòng)相作為樣品溶劑 c、減少進(jìn)樣體積J、保留時(shí)間波動(dòng)原 因 解決方法1、溫控不當(dāng)調(diào)好柱溫2、流動(dòng)相組分變化防止變化(蒸發(fā)、反應(yīng)等)

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每天用足夠的時(shí)間來維護(hù)色譜柱,您將節(jié)省更多用于處理色譜柱故障的時(shí)間,同時(shí)您的色譜柱的壽命也會(huì)變得更長(zhǎng)!色譜柱的使用壽命,除了與所分析的樣品和流動(dòng)相及使用頻率有關(guān)外,主要的是與日常的維護(hù)密切相關(guān)。色譜柱的使用壽命主要是根據(jù)柱效和柱壓兩個(gè)指標(biāo)來衡量,如果一支色譜柱柱效太低或柱壓太高,通常被認(rèn)為該色譜柱的使用壽命已經(jīng)結(jié)束。因此,延長(zhǎng)色譜柱使用壽命的關(guān)鍵是,**引起柱效下降和柱壓升高的因素。通過以下幾點(diǎn)幫助您完成色譜柱的日常維護(hù)工作。

流動(dòng)相的pH 值

由于硅膠基質(zhì)的填料中存在Si-C和Si-O鍵,流動(dòng)相超過其pH范圍將會(huì)導(dǎo)致硅膠基質(zhì)溶解和鍵合相碳鏈斷裂,使柱效下降,壽命變短。由于流動(dòng)相的pH控制不當(dāng)而對(duì)色譜柱造成的損害,通常很難使色譜柱恢復(fù),因此必須認(rèn)真對(duì)待,嚴(yán)格控制流動(dòng)相的pH值。。

去除樣品和流動(dòng)相中的固體顆粒

樣品和流動(dòng)相中含有的固體顆粒物質(zhì)會(huì)堵塞色譜柱篩板,篩板被堵不僅會(huì)引起柱壓升高,而且也會(huì)引起柱效下降,因?yàn)楹Y板的堵塞會(huì)引起液流不均,導(dǎo)致色譜峰形拖尾、變寬,甚至出現(xiàn)雙峰,從而使柱效下降。因此,建議使用超純水和色譜純?cè)噭?,在分析前?duì)樣品進(jìn)行超聲、針筒過濾,流動(dòng)相過0.45µm 濾膜,尤其是流動(dòng)相加入了緩沖鹽(如NaH2PO4等),必須過濾。

博納艾杰爾為您提供了一系列高質(zhì)量的過濾產(chǎn)品,外殼采用聚丙烯材料,濾膜為意大利進(jìn)口。種類有:混合纖維素(MCM)、尼龍(Nylon)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、 聚醚砜(PES)、增強(qiáng)型纖維素膜(Reg. Cellulose)、玻璃纖維、PP等,常用規(guī)格為:直徑13mm、25mm、33mm;孔徑:0.45µm、0.22µm等。

使用保護(hù)柱或在線過濾器

樣品和流動(dòng)相經(jīng)過濾后并不能****固體顆粒物質(zhì),因?yàn)楸玫哪p、密封圈和管路的老化也會(huì)產(chǎn)生固體顆粒物,這些固體顆粒被流動(dòng)相帶入色譜柱,堵塞篩板,導(dǎo)致柱壓升高、柱效下降。保護(hù)柱和在線過濾器上都有篩板,其孔徑與色譜柱篩板孔徑相同,因此可以阻止固體顆粒物質(zhì)到達(dá)色譜柱,有效防止色譜柱篩板的堵塞。由于柱壓升高在分析故障中占很大比例,因此,除對(duì)樣品和流動(dòng)相進(jìn)行過濾外,建議您在色譜柱進(jìn)樣端加上保護(hù)柱或在線過濾器。

正確使用緩沖鹽

緩沖液可以提供離子平衡的反離子,并使流動(dòng)相保持**的離子強(qiáng)度和p H 值,減少拖尾。緩沖鹽通常易溶于水,難溶于有機(jī)溶劑,因此緩沖鹽使用不當(dāng)會(huì)致其析出,堵塞填料基質(zhì)上的微孔和顆粒間的空隙,使填料板結(jié),柱壓上升;同時(shí)阻礙了基質(zhì)上鍵合的碳鏈自由舒展,使色譜柱的保留能力下降,柱效降低。緩沖鹽析出后,去除非常困難,因此,正確的使用緩沖鹽對(duì)延長(zhǎng)色譜柱使用壽命非常重要。

正確使用緩沖鹽的目的是防止緩沖鹽析出,因此正確使用緩沖鹽的方法可歸結(jié)為一句話:使用前要過渡,使用后要沖洗。

具體方法如下:

a . 等度條件:使用緩沖鹽前用過渡流動(dòng)相以1.0mL/min 流速?zèng)_洗20-30倍柱體積,然后再使用含有緩沖鹽的流動(dòng)相;使用后去除緩沖鹽的方法是用過度流動(dòng)相以1.0mL/min流速?zèng)_洗30倍柱體積,然后以純有機(jī)溶液沖洗30倍柱體積保存。

b .梯度條件:用含有緩沖鹽的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫之前,用與初始流動(dòng)相組成相同的過渡流動(dòng)相以1.0mL/min流速?zèng)_洗30倍柱體積,再開始梯度的運(yùn)行;分析完成后,再用過渡流動(dòng)相以1.0mL/min沖洗色譜柱30倍柱體積,然后以純有機(jī)溶液沖洗30倍柱體積保存。

另外,在使用緩沖液的過程中還要注意以下幾點(diǎn):

a .避免使用鹽酸鹽,鹽酸鹽對(duì)鋼質(zhì)有腐蝕作用;

b .緩沖液需現(xiàn)配現(xiàn)用,往往緩沖液是良好的菌類培養(yǎng)液,隔天或放置長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)時(shí)會(huì)發(fā)生很多怪現(xiàn)象;

c .使用緩沖液要及時(shí)掌握pH范圍,做到胸中有數(shù);

d .清洗液路和柱子時(shí),有溫控可加熱到30攝氏度易于沖洗;

e.長(zhǎng)時(shí)間用緩沖溶液要注意觀察接頭處有無析出,若有白色鹽類析出,定期用10%硝酸沖洗液路(拆下柱子,沖洗30mL10%硝酸溶液,再用5倍水沖洗)可以避免液路的堵塞;

f.選擇緩沖液要用可靠的試劑,避免不純的鹽類造成不必要的麻煩;

過渡流動(dòng)相是指有機(jī)相和水相的組成與分析流動(dòng)相相同,但是不含緩沖鹽的溶液。

防止強(qiáng)保留物質(zhì)在色譜柱中存留

強(qiáng)保留物質(zhì)和大分子化合物在色譜柱中累積,對(duì)樣品中的化合物產(chǎn)生額外的保留行為,不僅引起峰形變寬、拖尾,使柱效下降,同時(shí)也會(huì)引起保留時(shí)間的變化,累積到**程度時(shí)還會(huì)導(dǎo)致柱壓升高。由于強(qiáng)保留物質(zhì)和大分子化合物對(duì)色譜分離的影響是一個(gè)累積效應(yīng),需要**的時(shí)間才會(huì)體現(xiàn)出來,但對(duì)許多樣品特別是復(fù)雜樣品而言,很難判斷其是否含有強(qiáng)保留物質(zhì),因此要防止強(qiáng)保留物質(zhì)的累積,需要在每天的日常維護(hù)中用純甲醇或乙腈30倍柱體積清洗色譜柱。

色譜柱的再生

a、反相柱

以下列溶劑順序沖洗30倍柱體積

乙腈-水(5:95) → THF → 乙腈-水(5:95)

b、正相柱

以下列溶劑順序沖洗30倍柱體積

正己烷 → 二氯甲烷 → 異丙醇 → 二氯甲烷 → 流動(dòng)相

c、硅膠柱(Si)除水

30mL 2.5% 2,2 二甲氧基丙烷和2.5%冰醋酸正己烷溶液沖洗柱子

**液相色譜(HPLC)作為一種分離技術(shù)和方法,目前已經(jīng)發(fā)展到一個(gè)全新的階段。高精度的輸液泵,應(yīng)用廣泛的色譜分離柱,低噪音、高靈敏度的各種檢測(cè)器和功能強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)的出現(xiàn),都推動(dòng)了液相色譜技術(shù)的迅猛發(fā)展。液相色譜儀正以它分辨率高、分析速度快和應(yīng)用廣泛的優(yōu)點(diǎn)倍受儀器分析工作者的青睞,廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品檢測(cè)等領(lǐng)域。

1、**液相色譜儀的基本工作試驗(yàn)方法

**液相色譜儀如圖1所示,是由溶液貯器、高壓泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜分離柱、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)幾部分組成。

高壓泵從溶液貯器中抽走流動(dòng)相,流經(jīng)整個(gè)儀器系統(tǒng),形成密閉的液體流路。樣品通過進(jìn)樣系統(tǒng)注入色譜分離柱,在柱內(nèi)進(jìn)行分離。柱流出液進(jìn)入檢測(cè)器,使已被分離的組分逐一被檢測(cè)器收集,并將響應(yīng)值轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)后經(jīng)放大被數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜峰,通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)記錄的峰值進(jìn)行存儲(chǔ)和計(jì)算[1]。

液相色譜儀是依靠色譜柱進(jìn)行分離的。研究證明:物質(zhì)的色譜過程是指物質(zhì)分子在相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相(液相和固相)中分配“平衡”的過程。液相色譜是以具有吸附性質(zhì)的硅膠顆粒為固定相,各種洗脫液為流動(dòng)相。當(dāng)液體樣品在載體流動(dòng)相的推動(dòng)下,在液-固兩相間作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),由于各組分在兩相中的分配系數(shù)(K)不同,則使各自的移動(dòng)速度不同,即產(chǎn)生差速遷移。各組分在兩相間經(jīng)過多次分配,從而達(dá)到使混合物分離的目的。

2、輸液泵的常見故障及對(duì)策:

輸液泵/高壓泵是保證HPLC系統(tǒng)流路暢通、流量**和壓力穩(wěn)定的重要儀器部件,目前多用往復(fù)式恒流柱塞泵,主要由柱塞桿、密封墊圈和兩個(gè)單向閥組成,用馬達(dá)帶動(dòng)凸輪驅(qū)動(dòng)柱塞桿作吸液和排液的往復(fù)運(yùn)動(dòng)。常分為單柱塞泵、并聯(lián)柱塞泵、串聯(lián)柱塞泵和柱塞隔膜泵等類型。流動(dòng)相混合方式分為低壓混合和高壓混合。常見泵的故障主要有以下幾種,并提供解決的辦法。

2.1單向閥故障 由于球與閥座密封不嚴(yán),液體倒流,造成壓力不穩(wěn),甚至球與閥座粘在一起阻死。密封不嚴(yán)主要是污染或氣泡引起,球與閥座粘連也是由于污染和磨損造成。

為避免單向閥中的寶石球和閥座被污染,流動(dòng)相應(yīng)使用HPLC級(jí)的溶劑,并且配好的流動(dòng)相**要用0.45u濾膜過濾和脫氣。如果泵被微粒污染,可分別用水、甲醇、異丙醇、二氯甲烷依次沖洗。沖洗時(shí)應(yīng)打開泄液閥,***后再用所用的溶液沖洗整個(gè)系統(tǒng)。

氣泡進(jìn)入閥中會(huì)緊貼在閥體的一側(cè),使寶石球難返回到閥座,引起倒流,泵的壓力和流速會(huì)明顯改變。此時(shí),應(yīng)立即打開泄液閥,大流量(2ml/min)沖洗泵,直至排除液為直線型。因?yàn)榧状伎蓾?rùn)濕泵內(nèi)壁,擠出氣泡,故也可使用脫過氣的甲醇沖洗泵。長(zhǎng)期不用的泵或新裝的泵頭應(yīng)該用甲醇趕氣泡。泵進(jìn)氣泡也可在泵頭上排氣泡,即用扳手固定住進(jìn)氣泡的泵頭,擰開輸出管道的壓帽,手動(dòng)泵送液,可見到氣泡從孔中擠壓出來,直至無氣泡排出將壓帽擰緊。

采取上述辦法仍不能使壓力穩(wěn)定,應(yīng)考慮是否密封墊壞了?或單向閥磨損、球不光滑等,需更換部件。

2.2泵墊圈故障泵墊圈常見的故障是滲漏和墊圈受損污染系統(tǒng)。液相色譜系統(tǒng)一般情況下不要使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液,因?yàn)檫@會(huì)損壞密封墊和柱塞桿。密封墊圈與運(yùn)動(dòng)著的柱塞桿緊密接觸,可使柱塞在泵頭自由運(yùn)動(dòng)而流動(dòng)相不漏出來,它是液相色譜系統(tǒng)中***易磨損的部件。有條件的實(shí)驗(yàn)室可三個(gè)月更換一次墊圈,防止泵系統(tǒng)污染。如果用緩沖鹽作流動(dòng)相則更會(huì)加速墊圈的磨損,應(yīng)及時(shí)沖洗。當(dāng)墊圈損壞時(shí),表現(xiàn)為:泵壓力不穩(wěn)、泵頭漏液。一旦出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象,應(yīng)盡快更換新墊圈。

為避免上述故障的發(fā)生,我們?cè)诜治龉ぷ髦袘?yīng)注意以下幾點(diǎn):

① 使用超純水(18MΩ.cm)、純度級(jí)別較高的試劑和色譜級(jí)溶劑配制流動(dòng)相;

**液相色譜常見問題分析與對(duì)策 液相色譜使用方法(圖1)

② 配好的流動(dòng)相**要抽濾脫氣,即便儀器有在線脫氣裝置,也***好在上機(jī)前進(jìn)行抽濾。真空抽濾既過濾顆粒也脫了氣泡,非常有效。

③ 泵在起動(dòng)前**要通過泄液閥抽凈泵里的空氣。

④ 用緩沖鹽洗脫時(shí),分析結(jié)束后**要用水沖洗泵和整個(gè)流路系統(tǒng),不要讓腐蝕性溶液滯留泵中,***后用有機(jī)溶劑充滿系統(tǒng)。

3、色譜分離柱的使用與維護(hù)

在前述儀器工作試驗(yàn)方法部分,我們已經(jīng)指出,液相色譜儀的分離是在色譜分離柱中實(shí)現(xiàn)的。我們目前工作中多采用反相色譜柱,如何保護(hù)好分離柱減少柱的污染是延長(zhǎng)柱壽命的關(guān)鍵。

3.1怎樣維護(hù)好色譜分離柱

加保護(hù)柱(預(yù)柱)是保護(hù)分離柱的有效辦法。保護(hù)柱是根內(nèi)裝填料與分離柱性質(zhì)相近的短柱,接在分離柱之前,或代替流路過濾器。保護(hù)柱的作用是收集和阻塞分離柱口的化學(xué)垃圾,這些垃圾如果直接進(jìn)入分離柱會(huì)逐漸堆積在柱頭,***終降低柱效能。保護(hù)柱是消耗品,如分析血漿樣品,一般分析50個(gè)樣品后需更換新柱芯。

避免高壓沖擊分離柱。一般色譜柱都能承受得起高壓,但經(jīng)不住突然變化的高壓沖擊,這將改變柱床體積,影響柱效。引起高壓沖擊的原因主要有:進(jìn)樣器的樣品閥的緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)、泵啟動(dòng)太快、柱切換等操作。用手動(dòng)進(jìn)樣閥時(shí)的壓力變化不大,自動(dòng)進(jìn)樣閥由于切換較慢,可能會(huì)造成壓力沖擊。

合理選擇分離柱。我們知道,選擇色譜分離柱主要根據(jù)兩點(diǎn),一是根據(jù)待測(cè)組分的分子量的大小;二是根據(jù)流動(dòng)相條件,包括PH值、離子強(qiáng)度和溶劑極性等。傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)的鍵合相柱要求流動(dòng)相PH值在3-7之間,**PH值(>8)的流動(dòng)相能溶解硅膠,使鍵合相流失。而目前利用先進(jìn)的雜化顆粒技術(shù)研制的高純硅膠顆粒填料(如Waters公司的XTerra色譜柱),集硅膠和多孔聚合物填料的優(yōu)點(diǎn)為一體,使有機(jī)硅烷單元取代了相當(dāng)一部分占據(jù)顆粒內(nèi)部和表面位置的硅羥基,使這種新型填料具有分辨率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、PH范圍寬(1-12)的優(yōu)勢(shì),其性能突破了傳統(tǒng)**液相色譜柱的極限。所以**要根據(jù)分析的對(duì)象、流動(dòng)相的條件選擇合適的分離柱,茫然時(shí)可向公司的技術(shù)人員咨詢。

定期沖洗分離柱。每次分析工作結(jié)束時(shí),沖洗完緩沖鹽后,***后要過度到用強(qiáng)溶劑沖洗柱子,如可用色譜純甲醇、乙腈沖洗反相C18柱,目的是沖去吸附在柱上的強(qiáng)保留組分。如果用甲醇/水為流動(dòng)相也應(yīng)這樣沖洗柱子,在**程度上可恢復(fù)柱效。


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